Isolation and characterization of lytic bacteriophage for biocontrol of Staphylococcus aureus in milk and dairy products

Abstract

Staphylococcus aureus is one of the most virulent species in the genus Staphylococcus. The contamination of this bacterium can be frequently found, especially in milk and dairy products. Generally, chemicals and/or antibiotics have been used to control foodborne pathogens in food industry. These methods often have negative effects. They can cause mutation which leads to antibiotic resistances of bacteria and negative impact on consumer health as well as the environmental impact due to chemical residues. Nowadays, using bacteriophages for control of pathogenic bacteria is an interesting alternative because it has no negative effect on food products, consumers or environment. Therefore, this study aimed to isolate bacteriophages specific to S. aureus 01 isolated from raw milk obtained from Nong Pho Veterinary Clinic, Ratchaburi province. In addition, some properties of S. aureus 01-specific bacteriophages were investigated as the guideline for controlling S. aureus in milk and dairy products. A total of 105 samples were collected for bacteriophage isolation. These include raw milk, livestock drinking water, waste from livestock farms samples as well as sewage samples from shops in fresh food markets in Nakhon Pathom and Ratchaburi provinces. S. aureus 01-specific bacteriophages were found in 23 out of 105 samples. Thirty sample of lytic bacteriophages (Sau_RP01- Sau_RP30) were obtained after purification process. The host range tests of all 30 isolates showed that 21 isolates could infect all S. aureus strains used in this study. In addition, all bacteriophage isolates had no cross-genus infectivity. The genomes of these bacteriophages were larger than 19 kbp compared to Lambda DNA/StyI marker. The restriction analysis of bacteriophage genome using 4 restriction enzymes which included EcoRI, StyI, HindII and SacI could classify these bacteriophages into 10 groups. Nonetheless, the results of host range test were also used for selection of bacteriophages for further studies. It was found that Sau_RP4, Sau_RP11, Sau_RP15 and Sau_RP29 produced the largest clear zones level. These 4 bacteriophages were therefore selected for the morphological study under the transmission electron microscopy. The results showed that these baceriophages were members of Siphoviridae family. The determination of multiplicity of infection (MOI) indicated that the optimal MOI of these bacteriophages were at MOI0.1. In addition, at this MOI, Sau_RP15 could reduce S. aureus 01 titer by 10.32±0.27 log CFU/ml when compared to the controlled experiment within 2 h which was higher than other bacteriophages. Moreover, the titer of this bacteriophage also increased by 12.03±1.08 log PFU/ml within 5 h. Therefore, Sau_RP15 was selected for further studies. The single-step growth curve of Sau_RP15 revealed that Sau_RP15 had 30 min of latent period and burst size of 901.27±244.28 PFU/infected cell. The effects of temperature and pH on the survival of Sau_RP15 showed that Sau_RP15 was stable at 4, 28 and 37 °C and in the broad pH range of 5-10. The control of S. aureus 01 in pasteurized milk samples showed that at high contamination level (107 CFU/ml) Sau_RP15 could reduce S. aureus 01 titer by 1.44±0.51 log CFU/ml after the first hour of treatment and by 3.81±0.16 log CFU/ml at 8 hours when compared to the controlled experiment. At low contamination level (104 CFU/ml) Sau_RP15 reduced S. aureus 01 titer by 1.95±0.13 log CFU/ml after the first hour of treatment and S. aureus 01 titer could not be detected at 8 hours. However, the bacteriophage titers were relatively constant throughout the experimental period in both cases.

Staphylococcus aureus เป็นสปีชีส์หนึ่ง ซึ่งมีความสามารถในการก่อโรคได้รุนแรงที่สุดในสกุล Staphylococcus การปนเปื้อนเชื้อนี้สามารถพบได้บ่อยครั้งโดยเฉพาะอย่างยิ่งในนมและผลิตภัณฑ์นม โดยทั่วไปการควบคุมจุลินทรีย์ก่อโรคในอุตสาหกรรมอาหาร มักใช้สารเคมี และ/หรือ ยาปฎิชีวนะเป็นหลัก วิธีการควบคุมดังกล่าวมักก่อให้เกิดผลกระทบเชิงลบ ได้แก่ การก่อให้เกิดการกลายพันธุ์ซึ่งนำไปสู่การดื้อยาปฏิชีวนะของแบคทีเรีย และก่อให้เกิดปัญหาในด้านความปลอดภัยของผู้บริโภค รวมทั้งส่งผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมอันเนื่องมาจากการตกค้างของสารเคมี ในปัจจุบันการใช้แบคเทอริโอฟาจสำหรับการควบคุมแบคทีเรียก่อโรคถือเป็นอีกทางเลือกหนึ่งที่น่าสนใจซึ่งไม่ส่งผลกระทบเชิงลบต่อผลิตภัณฑ์อาหาร ผู้บริโภค หรือสิ่งแวดล้อม ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกแบคเทอริโอฟาจที่มีความจำเพาะต่อ S. aureus 01 ซึ่งคัดแยกได้จากนมดิบโดยได้รับความอนุเคราะห์จากโรงพยาบาลสัตว์หนองโพ จังหวัดราชบุรี พร้อมทั้งศึกษาคุณสมบัติบางประการของแบคเทอริโอฟาจที่คัดแยกได้ สำหรับเป็นแนวทางในการประยุกต์ใช้ควบคุม S. aureus ในนมและผลิตภัณฑ์นม จากตัวอย่าง 105 ตัวอย่างซึ่งถูกเก็บมาสำหรับคัดแยกไลติคแบคเทอริโอฟาจทั้งนมดิบ น้ำดื่มโค ของเสียจากฟาร์มปศุสัตว์ รวมถึงน้ำทิ้งจากร้านค้าในตลาดสดทั้งในจังหวัดนครปฐมและราชบุรี พบไลติคแบคเทอริโอฟาจที่มีความจำเพาะกับ S. aureus 01 ทั้งสิ้น 23 ตัวอย่างจากตัวอย่างทั้งหมด ภายหลังการทำบริสุทธิ์ได้แบคเทอริโอฟาจทั้งสิ้น 30 ตัวอย่าง (Sau_RP01- Sau_RP30) จากผลการศึกษาความสามารถของแบคเทอริโอฟาจทั้ง 30 ตัวอย่าง ในการติดเชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นพบว่าแบคเทอริโอฟาจ 21 ตัวอย่าง สามารถทำให้เกิดการติดเชื้อกับ S. aureus ทุกสายพันธุ์ที่ใช้ในการทดสอบ นอกจากนี้แบคเทอริโอฟาจทุกตัวอย่างไม่สามารถทำให้เกิดการติดเชื้อกับแบคทีเรียข้ามสกุลได้ จากการศึกษาลักษณะจีโนมของแบคเทอริโอฟาจทั้ง 21 ตัวอย่าง พบว่าจีโนมของ แบคเทอริโอฟาจเหล่านี้มีขนาดใหญ่กว่า 19 kbp เมื่อเปรียบเทียบกับ Lambda DNA/StyI marker จากการวิเคราะห์จีโนมของแบคเทอริโอฟาจโดยการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ EcoRI, StyI, HindII และ SacI ทำให้สามารถจัดกลุ่มแบคเทอริโอฟาจได้ทั้งหมด 10 กลุ่ม อย่างไรก็ตามผู้วิจัยยังใช้ผลจากการศึกษาความสามารถของแบคเทอริโอฟาจในการติดเชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นประกอบการตัดสินใจเพื่อคัดเลือกแบคเทอริโอฟาจ ซึ่งพบว่าแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP4, Sau_RP11, Sau_RP15 และ Sau_RP29 มีระดับการเกิดโซนใสสูงที่สุด ดังนั้นจึงเลือก แบคเทอริโอฟาจทั้ง 4 ตัวอย่าง สำหรับการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน พบว่าแบคเทอริโอฟาจทั้ง 4 ตัวอย่าง จัดอยู่ใน Family Siphoviridae การศึกษาผลของอัตราส่วนแบคเทอริโอฟาจต่อโฮสต์เซลล์ในการติดเชื้อ (multiplicity of infection, MOI) พบว่าแบคเทอริโอฟาจเหล่านี้ มีอัตราส่วนของแบคเทอริโอฟาจต่อโฮสต์เซลล์ที่เหมาะสมต่อการติดเชื้ออยู่ที่ MOI 0.1 อีกทั้งที่ MOI 0.1 แบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 สามารถลดปริมาณ S. aureus 01 ได้ถึง 10.32±0.27 log CFU/ml เมื่อเทียบกับการทดลองควบคุม ภายในระยะเวลา 2 ชั่วโมง ซึ่งมากกว่าแบคเทอริโอฟาจตัวอย่างอื่น ๆ ณ เวลาเดียวกัน นอกจากนี้ยังสามารถเพิ่มจำนวนได้ถึง 12.03 ±1.08 log PFU/ml ภายในระยะเวลา 5 ชั่วโมง ดังนั้นผู้วิจัยจึงเลือกแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 สำหรับการศึกษาต่อไป จากผลการศึกษาการเจริญของ แบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 พบว่าแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 มีระยะแฝง (latent period) เท่ากับ 30 นาที และค่าเฉลี่ยของแบคเทอริโอฟาจที่ปลดปล่อยออกมาต่อแบคทีเรียหนึ่งเซลล์ (Burst size) เท่ากับ 901.27±244.28 PFU/infected cell การศึกษาผลของอุณหภูมิและ pH ต่อการอยู่รอดของแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 พบว่าแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 4 28 และ 37 องศาเซลเซียส และมีความเสถียรต่อความเป็นกรด-ด่างอยู่ในช่วงที่กว้าง ตั้งแต่ pH 5-10 จากการทดลองการควบคุม S. aureus 01 ในตัวอย่างนมโคพาสเจอร์ไรส์ โดยจำลองสภาวะการปนเปื้อนของแบคทีเรียทั้งในปริมาณสูงและต่ำ พบว่าการใช้แบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 (108 PFU/ml) สำหรับการควบคุม S. aureus 01 ในตัวอย่างนมพาสเจอร์ไรส์ที่มีระดับการปนเปื้อนสูง (107 CFU/ml) สามารถลดความหนาแน่นของ S. aureus 01 ได้ 1.44±0.51 log CFU/ml ตั้งแต่ชั่วโมงแรกและลดได้ 3.81±0.16 log CFU/ml ในชั่วโมงที่ 8 เมื่อเปรียบเทียบกับการทดลองควบคุม ขณะที่การจำลองสภาวะการปนเปื้อนในระดับต่ำ (104 CFU/ml) พบว่าแบคเทอริโอฟาจ Sau_RP15 สามารถลดความหนาแน่นของ S. aureus 01 ได้ 1.95±0.13 log CFU/ml เมื่อเปรียบเทียบกับการทดลองควบคุม ตั้งแต่ชั่วโมงแรกและลดความหนาแน่นของ S. aureus 01 จนไม่สามารถตรวจวัดได้ในชั่วโมงที่ 8 อย่างไรก็ตามความหนาแน่นของแบคเทอริโอฟาจมีปริมาณค่อนข้างคงที่ตลอดการทดลองในทั้งสองชุดการทดลอง