Isolation and characterization of bacteriophage specific for Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus is an important pathogen that causes foodborne illness. Generally, chemicals or antibiotics have been used to control pathogenic bacteria. However, the methods mentioned above have negative effects on consumer health. Moreover, antibiotic-resistant bacteria can occur by treating with antibiotics in long term treatment. Recently, bacteriophages have been increasing interested in biocontrol application of pathogens in food due to their high host specificity and not produce toxic residues. Therefore, the aim of this study was to isolate and characterize bacteriophages that are specific to S. aureus as a guideline for controlling S. aureus. In this study, S. aureus-specific bacteriophages were isolated from raw milk and sewage samples as well as pork washing water samples from pork butcher shops in Nakhon Pathom and Ratchaburi provinces from 14 out of 247 samples. After purification 37 isolates of lytic bacteriophages (Sau_RW01- Sau_RW37) were obtained. The host range tests of these bacteriophages showed that 8 isolates could infect 11 S. aureus strains. Sau_RW01 produced highest level clear zone, therefore it was selected for the further experiments. In addition, Sau_RW11 and Sau_RW12 could cross-species infect S. Enteritidis. The cross-species infectivity test of bacteriophages by using efficiency of plating (EOP) method showed that EOP values of S. Enteritidis infection of Sau_RW11 and Sau_12 were 0.00381 and 0.00057, respectively, which indicated the low efficiencies. Genome analysis of ten phages (Sau_RW01, Sau_RW02, Sau_RW09, Sau_RW05, Sau_RW11, Sau_RW12, Sau_RW20, Sau_RW21, Sau_RW32 and Sau_RW33) were performed by restriction analysis using 3 restriction enzymes which included EcoRI, HinfI and StyI. Bacteriophages were classified into 8 groups when considered the results of host range test and the restriction analysis. The morphological results of bacteriophages Sau_RW01, Sau_RW11 and Sau_RW12 indicated that these phages were classified into family Siphoviridae. The determination of multiplicity of infection of Sau_RW01 showed that the titer of S. aureus reduced at MOI 10, 1 and 0.1 within 5 h by 20.67, 19.73 and 20.14 log PFU/mL, respectively. It can be seen that at the decrease of S. aureus titer by Sau_RW01 at MOI 0.1 was not different from MOI 10 and 1. Therefore, the optimal multiplicity of infection was at MOI 0.1. The study of thermal sensitivity test of bacteriophages showed that Sau_RW01 was stable at 4, 28 and 37 °C. However, phage titer reduced by 1.27 log PFU/mL at 50 °C within 1 hr and could not be detected at 60 and 70 °C. In addition, one step growth curve revealed that latent period of Sau_RW01 was 30 minutes, burst was at period 100 minutes and burst size was 151 PFU/infected cell.

Staphylococcus aureus เป็นแบคทีเรียก่อโรคสำคัญชนิดหนึ่ง ซึ่งก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ (food poisoning) โดยทั่วไปการควบคุมเชื้อก่อโรคในอาหารมักใช้สารเคมีหรือยาปฏิชีวนะเป็นหลัก อย่างไรก็ตามวิธีที่กล่าวไปข้างต้นนั้นส่งผลกระทบเชิงลบต่อสุขภาพของผู้บริโภค นอกจากนี้การใช้ยาปฏิชีวนะในการรักษาเป็นเวลานาน อาจก่อให้เกิดแบคทีเรียดื้อต่อยาปฏิชีวนะ เมื่อไม่นานมานี้แบคเทอริโอเฟจได้รับความสนใจมากขึ้นสำหรับการประยุกต์ใช้ควบคุมเชื้อก่อโรคทางชีวภาพในอาหาร เนื่องจากมีความจำเพาะต่อเซลล์เจ้าบ้านสูง และไม่ผลิตสารพิษตกค้าง ดังนั้นวัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อคัดแยกแบคเทอริโอเฟจที่จำเพาะต่อ S. aureus และศึกษาคุณลักษณะต่าง ๆ เพื่อเป็นแนวทางสำหรับควบคุม S. aureus ในงานวิจัยนี้คัดแยกแบคเทอริโอเฟจที่จำเพาะต่อ S. aureus ได้ 14 ตัวอย่าง จากตัวอย่าง นมดิบ น้ำเสียท่อระบายน้ำ รวมถึงน้ำล้างเนื้อหมูจากร้านค้า ในจังหวัดนครปฐมและราชบุรี ทั้งหมด 247 ตัวอย่าง ภายหลังการทำบริสุทธิ์ได้ไลติก แบคเทอริโอเฟจ (lytic bacteriophage) ทั้งสิ้น 37 ไอโซเลท (Sau_RW01- Sau_RW37) จากผลการศึกษาความสามารถในการเข้าทำลายแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นของแบคเทอริโอเฟจเหล่านี้ พบว่า แบคเทอริโอเฟจ 8 ไอโซเลท สามารถติดเชื้อ S. aureus 11 สายพันธุ์ โดยแบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 ให้ระดับโซนใสสูงสุด ดังนั้น จึงเลือกแบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 ในการทดลองต่อไป นอกจากนี้แบคเทอริโอเฟจ Sau_RW11 และ Sau_RW12 สามารถเกิดการติดเชื้อ S. Enteritidis อีกทั้งยังทดสอบประสิทธิภาพของแบคเทอริโอเฟจที่สามารถติดเชื้อข้ามสกุลด้วยวิธี Efficiency of plating (EOP) กับ S. Enteritidis พบว่า Sau_RW11 มีค่า EOP เท่ากับ 0.00381 และ Sau_RW12 มีค่า EOP เท่ากับ 0.00057 ซึ่งชี้ให้เห็นถึงประสิทธิภาพต่ำในการติดเชื้อข้ามสกุลนี้ จากผลการศึกษาจีโนมและการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 3 ชนิด ได้แก่ EcoRI, HinfI และ StyI ของแบคเทอริโอเฟจ 10 ไอโซเลท (Sau_RW01, Sau_RW02, Sau_RW09, Sau_RW05, Sau_RW11, Sau_RW12, Sau_RW20, Sau_RW21, Sau_RW32 และ Sau_RW33) เมื่อพิจารณาควบคู่กับความสามารถในการทำลายแบคทีเรียสายพันธุ์อื่น สามารถจัดกลุ่มแบคเทอริโอเฟจออกเป็น 8 กลุ่ม และผลการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของแบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01, Sau_RW11 และ Sau_RW12 พบว่า แบคเทอริโอเฟจทั้ง 3 ไอโซเลท จัดอยู่ในวงศ์ Siphoviridae ผลการศึกษาอัตราส่วนแบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 ต่อเซลล์เจ้าบ้านที่เหมาะสมในการติดเชื้อ (multiplicity of infection, MOI) พบว่า ที่ MOI 10, 1 และ 0.1 สามารถลดความหนาแน่น S. aureus ภายในระยะเวลา 5 ชั่วโมง โดยลดลงไป 20.67, 19.73 และ 20.14 log CFU/ml ตามลำดับ ซึ่งเห็นได้ว่าที่ MOI 0.1 แบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 สามารถลดความหนาแน่น S. aureus ได้ไม่แตกต่างกับ MOI 10 และ 1 ดังนั้น อัตราส่วนของแบคเทอริโอเฟจต่อเซลล์เจ้าบ้านที่เหมาะสมต่อการติดเชื้ออยู่ที่ MOI 0.1 จากการศึกษาผลของอุณหภูมิต่อการอยู่รอดของแบคเทอริโอเฟจ พบว่าแบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 4, 28 และ 37 องศาเซลเซียส ความหนาแน่นแบคเทอริโอเฟจลดลง 1.27 log PFU/ml ที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส ภายใน 1 ชั่วโมง และไม่สามารถตรวจพบแบคเทอริโอเฟจ ที่อุณหภูมิ 60 และ 70 องศาเซลเซียส นอกจากนี้ผลการศึกษากราฟการเจริญชี้ให้เห็นว่า แบคเทอริโอเฟจ Sau_RW01 มีช่วง latent period อยู่ที่ 30 นาที และ burst period อยู่ที่ 100 นาที อีกทั้งมี burst size ประมาณ 151 PFU/infected cell