การจัดจำแนกและการประเมินศักยภาพของสาหร่ายสีเขียวขนาดเล็ก Chlorosarcinopsis spp. ที่คัดแยกจากดินเพื่อการผลิตคีโตแคโรทีนอยด์

Abstract

คีโตแคโรทีนอยด์เป็นสารสีกลุ่มแคโรทีนอยด์ที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ เนื่องจากได้รับการนำไปใช้ประโยชน์ทั้งในด้านโภชนศาสตร์ เภสัชศาสตร์ รวมถึงอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำและสัตว์ปีก งานวิจัยนี้จึงมีจุดประสงค์เพื่อแยกเพาะเลี้ยงสาหร่ายขนาดเล็ก ที่มีความสามารถในการผลิตคีโตแคโรทีนอยด์อย่างโดดเด่นภายในท้องถิ่น ผลจากการคัดแยกสาหร่ายจากตัวอย่างดินที่เก็บจากโป่งยุบ อำเภอสวนผึ้ง จังหวัดราชบุรี สามารถคัดแยกสาหร่ายให้เป็นเชื้อบริสุทธิ์ได้ 5 ไอโซเลท (ให้ชื่อ PY01-PY05) สาหร่ายทั้งหมดสามารถเจริญเติบโตได้ทั้งแบบ autotroph mixotroph และ heterotroph โดยภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแบบ mixotroph (เติมอะซิเตท) โคโลนีของสาหร่ายเปลี่ยนจากสีเขียวไปเป็นสีแดงอย่างเห็นได้ชัดภายในระยะเวลาหนึ่งเดือน เมื่อนำตัวอย่างสาหร่ายในระยะที่มีสีแดงไปวิเคราะห์สารสีแคโรทีนอยด์ด้วยเครื่อง ultrahigh performance liquid chromatography (UPLC) พบว่า สาหร่ายทั้ง 5 ไอโซเลทมีความสามารถในการสังเคราะห์และสะสมคีโตแคโรทีนอยด์ อันได้แก่ adonixanthin echinenone 3-OH-echinenone และมี canthaxanthin เป็นรงควัตถุชนิดเด่น และจากการวิเคราะห์ปริมาณ canthaxanthin content ในสาหร่ายแต่ละไอโซเลท พบว่า ไอโซเลทที่ให้ปริมาณของค่าดังกล่าวสูงที่สุดคือ PY02 รองลงมาได้แก่ PY05 PY03 PY01 และ PY04 ตามลำดับ การศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาร่วมกับลักษณะทางอณูชีววิทยาของยีน tufA และ 18S rDNA บ่งชี้ว่าสาหร่ายโป่งยุบทั้ง 5 ไอโซเลทเป็นสาหร่ายในสกุล Chlorosarcinopsis และแม้ว่าลักษณะทางสัณฐานวิทยาภายใต้กล้องจุลทรรศน์ของสาหร่ายทั้ง 5 นั้นจะมีความคล้ายคลึงกันมาก หากแต่ ข้อมูลของลักษณะทางสรีรวิทยา (ชนิดของแหล่งคาร์บอนจากภายนอกที่สาหร่ายสามารถนำไปใช้ ระดับความสามารถในการทนเค็ม และสีของโคโลนีบนอาหารสูตร Bold’s basal medium) และลักษณะทางอณูชีววิทยา (RAPD และ 18S rDNA) สามารถจัดจำแนกสาหร่ายเหล่านี้ออกเป็น 2 กลุ่ม โดยกลุ่มที่ 1 ประกอบไปด้วยสาหร่ายไอโซเลท PY01 PY02 PY03 และ PY04 ในขณะที่กลุ่มที่ 2 มีไอโซเลท PY05 เพียงชนิดเดียว จากคุณสมบัติที่มีปริมาณ canthaxanthin content สูงสุดของสาหร่ายไอโซเลท PY02 สาหร่ายดังกล่าวจึงถูกเลือกมาศึกษาต่อถึงผลของสภาวะขาดแคลนไนโตรเจน และปริมาตรอาหารที่แตกต่างกันต่อการเจริญเติบโตและการผลิตคีโตแคโรทีนอยด์ ผลจากการศึกษาพบว่า สาหร่าย PY02 มีการสร้างมวลชีวภาพเพิ่มขึ้นถึง 16% เมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็งที่มีไนโตรเจนลดลง 50% นอกจากนี้แล้วปริมาณ canthaxanthin content ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจาก 520 ไปเป็น 1504 และ 1427 µg.g-1DW (P<0.05) เมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารที่มีไนโตรเจนลดลงเหลือ 50% และ 10% ตามลำดับ และเมื่อเพาะเลี้ยงสาหร่ายดังกล่าวในอาหารเหลวที่มีปริมาตรแตกต่างกัน ได้แก่ 15 30 และ 60 มิลลิลิตร พบว่า ปริมาตรอาหารที่น้อยลงส่งผลให้สาหร่ายมีศักยภาพในการผลิตมวลชีวภาพและ canthaxanthin เพิ่มสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) Ketocarotenoids are commercially important carotenoid pigments that have applications in the nutraceutical, pharmaceutical, aquaculture and poultry industries. This study aimed to isolate indigenous ketocarotenoid-producing algae with a distinctive capability from soil samples collected from Pongyup, Suanpueng, Ratchaburi province. Five isolates of axenic algal cultures were obtained (assigned PY01-PY05) and they were able to grow autotrophically, mixotrophically and heterotrophically. Remarkably, colony colour of the algae changed from green to deep red within one month under mixotrophic condition (adding acetate). Carotenoid pigment analysis of the red algal cells using ultrahigh performance liquid chromatography (UPLC) found that all 5 isolates can synthesize and accumulate the ketocarotenoids including adonixanthin, echinenone and 3-OH-echinenone, with canthaxanthin as a dominant pigment. Quantification of canthaxanthin in the algae disclosed that PY02 had the highest canthaxanthin content followed by PY05 PY03 PY01 and PY04, respectively. Morphological investigation along with tufA gene and 18S rDNA information revealed that all 5 Pongyup algae are members of the genus Chlorosarcinopsis. Although their morphological characters under light microscope were very similar, the biochemical characters (an ability to utilize the different exogenous carbon sources, salinity tolerance capacity and colony colour on the Bold’s basal medium) and molecular features (RAPD and 18S rDNA) classify the algae into two groups; the first group is PY01 PY02 PY03 and PY04 whereas the second group is only PY05. From the highest canthaxanthin content, the alga PY02 was selected to further study the effects of nitrogen deprivation and different media volume on its growth and canthaxanthin production. Interestingly, an increase of 16% in biomass production of PY02 was obtained from a 50% nitrogen reduction agar culture. Significant enhancements of canthaxanthin content from 520 to 1504 and 1427 µg.g-1DW were detected (P<0.05) under 50% and 10% nitrogen culture condition, respectively. Notably, in liquid media volumes of 15, 30 and 60 ml, the lower volume offered a significantly higher biomass and canthaxanthin production (P<0.05).