Isolation and characterization of bacteriophages specific to Salmonella spp.

Abstract

Foodborne diseases can cause many cases of illness and death mostly because of foodborne bacterial pathogen infection. Generally, infectious patients are treated with antibiotics. However, emergence of drug-resistant bacteria has become a serious problem in medical treatment nowadays. Bacteriophage treatment could be an alternative approach to control foodborne pathogens, since bacteriophages are viruses that can only infect and lyse specific bacterial cells. In this study, ninety-seven phages were isolated from twenty sewage samples collected in Nakhon Pathom and Nonthaburi provinces. Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis were used to serve as hosts for phage isolation. Fifty-one phage isolates formed clear plaques and were selected for host range test. Host range test was conducted by spot test using Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and 20 serovars of Salmonella as tested bacteria. Spot test results revealed that the tested phages were able to infect most Salmonella serovars excepted S. Worthington. Additionally, these phages did not infect E. coli, L. monocytogenes and S. aureus. Four phages including STy_RN5i1, STy_RN12i1, STy_RN25i1 and STy_RN29 were then selected to determine their efficiency of plating (EOP) and multiplicity of infection (MOI). The EOP results indicated that STy_RN29 was more efficient than other phages. STy_RN29 phage was able to lyse 8 out of 20 Salmonella serovars tested. Six of eight serovars were lysed with high efficiency (EOP > 0.5). The MOI results showed that STy_RN5i1 and STy_RN29 phages were able to reduce S. Typhimurium concentration more than 6 log CFU/mL after an hour at MOI 1 treatment. While STy_RN12i1 and STy_RN25i1 reduced their host with 5.65 and 2.57 log CFU/mL reduction, respectively. However, Salmonella regrowth was observed in all phage treatments. The results of phage genome analysis by restriction analysis revealed that these phages had double-strand DNA. Moreover, the morphological study using transmission election microscope (TEM) indicated that STy_RN5i1 and STy_RN12i1 phages were assigned to the family Podoviridae. While STy_RN25i1 and STy_RN29 were classified as members of the family Siphoviridae. These phages have ability to reduce Salmonella concentration and retard Salmonella growth. Therefore, the use of bacteriophages could be an interesting alternative option to control foodborne bacterial pathogens.

โรคที่เกิดจากอาหารเป็นสื่อกลางส่งผลให้มีผู้ป่วยและเสียชีวิตจำนวนมากซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในอาหาร ผู้ป่วยที่ติดเชื้อมักได้รับยาปฏิชีวนะเพื่อรักษาโรค อย่างไรก็ตาม การต้านยาปฏิชีวนะของแบคทีเรียกลายเป็นปัญหาทางการแพทย์ในปัจจุบัน การใช้แบคเทอริโอเฟจเป็นทางเลือกหนึ่งสำหรับควบคุมแบคทีเรียก่อโรคในอาหาร เนื่องจากแบคเทอริ-โอเฟจเป็นไวรัสที่สามารถเข้าติดเชื้อและทำลายเซลล์แบคทีเรียที่จำเพาะเท่านั้น ในการศึกษานี้ แบค-เทอริโอเฟจจำนวน 97 ไอโซเลทถูกคัดแยกได้จากตัวอย่างน้ำทิ้งจำนวน 20 ตัวอย่างในจังหวัดนครปฐมและนนทบุรีโดยใช้ Salmonella Typhimurium และ Salmonella Enteritidis เป็นเซลล์เจ้าบ้าน จากการคัดแยกเบื้องต้นพบเฟจจำนวน 51 ไอโซเลท สร้างพลาคใสบนสนามของเซลล์เจ้าบ้านจึงถูกคัดเลือกเพื่อทดสอบ host range ด้วยวิธี spot test โดยใช้ Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus และ Salmonella 20 ซีโรวาร์เป็นแบคทีเรียทดสอบ ผลการทดสอบพบว่าเฟจสามารถเข้าติดเชื้อ Salmonella ได้ทุกซีโรวาร์ ยกเว้น S. Worthington ไม่มีเฟจตัวอย่างใดสามารถเข้าติดเชื้อ E. coli, L. monocytogenes และ S. aureus ได้ เฟจ 4 ตัวอย่างได้แก่ STy_RN5i1, STy_RN12i1, STy_RN25i1 และ STy_RN29 ถูกคัดเลือกจากผลการทดสอบ host range เพื่อทดสอบประสิทธิภาพการทำลายเชื้อ (Efficiency of plating, EOP) และอัตราส่วนที่เหมาะสมต่อการติดเชื้อแบคทีเรีย (Multiplicity of infection, MOI) จากผลการทดสอบ EOP พบว่าเฟจ STy_RN29 มีประสิทธิภาพการทำลายเชื้อได้ดีที่สุดโดยสามารถเข้าติดเชื้อ Salmonella ได้ 8 จาก 20 ซีโรวาร์ และมีประสิทธิภาพสูง (EOP > 0.5) ในการทำลายเชื้อ 6 จาก 8 ซีโรวาร์ ผลการทดสอบ MOI ในการทำลายแบคทีเรีย แสดงให้เห็นว่า เฟจ STy_RN5i1 และ STy_RN29 สามารถเข้าทำลายและลดความหนาแน่นของ Salmonella ได้มากกว่า 6 log CFU/mL ตั้งแต่ชั่วโมงแรกที่ทดสอบที่ค่า MOI 1 ในขณะที่ เฟจ STy_RN12i1 และ STy_RN25i1 ลดเซลล์เจ้าบ้านได้ประมาณ 5.65 และ 2.57 log CFU/mL ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม พบการเจริญของ Salmonella ภายหลังจากทดสอบกับเฟจ (Salmonella regrowth) จากการศึกษาจีโนมของเฟจโดยวิธี restriction analysis แสดงให้เห็นว่าเฟจเหล่านี้มีสารพันธุกรรมเป็นกรดนิวคลิอิกสายคู่ (dsDNA) และจากการตรวจสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยาด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านสามารถระบุได้ว่า เฟจ STy_RN5i1 และ STy_RN12i1 จัดอยู่ในวงศ์ Podoviridae ส่วนเฟจ STy_RN25i1 และ STy_RN29 จัดอยู่ในวงศ์ Siphoviridae เฟจเหล่านี้มีประสิทธิภาพสำหรับลดความหนาแน่นและชะลอการเจริญของ Salmonella ที่ทดสอบ ดังนั้น การประยุกต์ใช้เฟจเพื่อควบคุมแบคทีเรียก่อโรคในอาหารอาจจะเป็นทางเลือกที่น่าสนใจได้อีกทางหนึ่ง