การพัฒนาวิธีตรวจสอบและการตั้งตำรับพอลิเพล็กซ์สำหรับนำส่งกรดนิวคลีอิก

Abstract

การศึกษานี้เป็นการพัฒนาวิธีวิเคราะห์ชนิดใหม่สำหรับการประมาณค่าการเกิดพอลิเพล็กซ์ที่สมบูรณ์ และการพัฒนาระบบนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอ โดยวิธีการใช้สีชนิดดูดซับนั้นพัฒนาขึ้นเพื่อประมาณค่าอัตราส่วนการเกิดพอลิเพล็กซ์ที่สมบูรณ์ระหว่างพอลิเมอร์ ประจุบวก เช่น พอลิเอทิลีนอิมีน และ ไคโตซาน กับกรดนิวคลีอิก วิธีการวิเคราะห์นี้อาศัยหลักการของการที่สีไดคลอโรฟลูออเรสซีนถูกดูดซับบนผิวอนุภาคที่มีประจุบวกของพอลิเพล็กซ์ที่เกิดขึ้นได้เองจากการรวมตัวกันของพอลิเมอร์ประจุบวกและกรดนิวคลิอิก ณ จุดที่ปริมาณของพอลิเมอร์ประจุบวกสมมูลกับกรดนิวคลิอิก ปรากฎการณ์นี้ทำให้สามารถเห็นพอลิเพล็กซ์เป็นสีชมพูหลังจากผ่านการปั่นเหวี่ยง ในอีกวิธีการหนึ่งนั้น การเติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์จะทำให้สีที่ถูกดูดซับอยู่ถูกปลดปล่อยออกมาจากผิวของพอลิเพล็กซ์ และทำให้เกิดเป็นสารละลายที่สามารถเรืองแสงสีเขียวได้เมื่อสังเกตภายใต้แสงยูวี (ความยาวคลื่น 366 นาโนเมตร) วิธีที่พัฒนาขึ้นนี้สามารถนำไปใช้ได้กับตำรับของดีเอ็นเอและเอสไออาร์เอ็นเอ โดยวิธีที่พัฒนาขึ้นนี้ให้ผลไปในทางเดียวกันกับผลที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยเจลและการวิเคราะห์ประจุบนพื้นผิว วิธีที่พัฒนาขึ้นนี้เป็นวิธีที่รวดเร็ว ง่าย มีความคุ้มทุน และปลอดภัยต่อผู้ปฏิบัติงาน โดยมีความเหมาะสมในการใช้สำหรับตรวจสอบอัตราส่วนที่เหมาะสมของพอลิเมอร์ประจุบวกและกรดนิวคลิอิกสำหรับการนำส่งยีน สำหรับการพัฒนาระบบตัวพาในการนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอนั้น ศึกษาโดยการใช้ไคโตซานร่วมกับพอลิแอลอาร์จินีนในการนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอเข้าสู่เซลล์ HeLa ที่มีการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสง เมื่อเปรียบเทียบกับการใช้พอลิเมอร์แต่ละชนิดเพียงชนิดเดียว พบว่าการใช้ไคโตซานร่วมกับพอลิแอลอาร์จินีนสามารถลดปริมาณของพอลิเมอร์แต่ละชนิดในการรวมตัวกับเอสไออาร์เอ็นเอได้ โดยเกิดเป็นอนุภาคขนาดนาโนที่มีประจุบนพื้นผิวเป็นบวกทีอัตราส่วนไคโตซานต่อพอลิแอลอาร์จินีนต่อเอสไออาร์เอ็นเอเท่ากับ 5/0.5/1โดยน้ำหนัก ที่อัตราส่วน 5/0.5/1 นี้ สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนโปรตีนเรืองแสงในเซลล์ได้ที่พีเอช 7.4 และ 6.4 โดยซีรัมไม่มีผลต่อประสิทธิภาพในการนำส่ง ในทางตรงกันข้าม ประสิทธิภาพในการนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอของไคโตซาน หรือพอลิแอลอาร์จินีนนั้นมีค่าต่ำที่พีเอชของสภาวะในร่างกาย (7.4) การใช้พอลิเมอร์ร่วมกันนี้ยังสามารถปกป้องเอสไออาร์เอ็นเอจากการถูกทำลายด้วยเอนไซม์อาร์เอ็นเอสเป็นเวลาอย่างน้อย 6 ชั่วโมง นอกจากนี้ จากการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ พบว่าตำรับของไคโตซาน/พอลิแอลอาร์จินีน/เอสไออาร์เอ็นเอนั้นมีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำ โดยมีค่าการรอดของเซลล์เท่ากับร้อยละ 75 การศึกษากลไกการผ่านเข้าเซลล์ของตำรับไคโตซาน/พอลิแอลอาร์จินีน/เอสไออาร์เอ็นเอ พบว่า ตำรับนี้เข้าสู่เซลล์โดยใช้แคลทริน, คาวีโอเล และสามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอได้โดยการเพิ่มความเป็นกรดให้แก่ระบบเอนโดโซม-ไลโซโซมอีกด้วย ดังนั้น ตำรับที่พัฒนาขึ้นโดยใช้ไคโตซานร่วมกับพอลิแอลอาร์จินีนนับเป็นระบบที่ง่ายต่อการเตรียม มีความปลอดภัยสำหรับการนำส่งเอสไออาร์เอ็นเอได้อย่างมีประสิทธิภาพ

In this study, a new method for estimation of polyplex formation and carrier system for siRNA delivery was developed. The dye adsorption method was developed for the estimation of cationic polymer i.e. polyethylenimine (PEI) and chitosan (CS) to nucleic acid ratio at which the polyplex was completely formed. The assay relied on the attraction of dichlorofluoresceinate dye to adsorb on self-assembling particles as induced by the positive surface charge of the polyplex as cationic polymer associated equivalently with nucleic acid. This phenomenon resulted in the appearance of pink colored pellets of the polyplex after centrifugation. By the other means, sodium hydroxide solution was added to free the adsorbed dye into the solution, producing green fluorescence solution under UV light (366 nm). This method was well applied to the polyplex formulations of polymers and plasmid DNA or siRNA and gave the results in agreement with those from gel retardation method and zeta potential analysis. The proposed method was a fast, facile, cost-effective and safely, suited for the investigation of the optimal polymer to nucleic acid ratio for gene delivery. The new cationic polymer system was also developed for delivering siRNA. For the development of carrier system for siRNA delivery, CS combined with PLA was formulated and evaluated its performance regarding the delivery of siRNA to HeLa cells expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP). The combination of CS and PLA could reduce the amounts of the polymers required for the complete complexation with siRNA, as compared with the single polymer using. Thereby forming positively charged, nanosized CS/PLA/siRNA polyplex was formed at the weight ratio of 5/0.5/1. The gene silencing efficiency of CS/PLA/siRNA at the optimal weight ratio of 5/0.5/1 satisfactorily silenced the endogenous EGFP gene at pH 7.4 as well as at pH 6.4 without deterrent effect from serum. In contrast, the transfection efficiency of CS/siRNA and PLA/siRNA was very low at physiological pH (7.4). The combined polymers could protect siRNA from RNase degradation over a period of at least 6 hr. Furthermore, MTT assay demonstrated that CS/PLA/siRNA complexes showed acceptably low cytotoxicity with 75 % cell viability. The uptake mechanism study showed CS/PLA/siRNA internalized into cell via clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis and enhanced transfection efficiency by facilitating acidification of endosome-lysosome system. Therefore, CS combined with PLA is easy-to-prepare, safe and promising for use as an efficient siRNA delivery vehicle.