การประยุกต์ใช้ดีเอ็นเอบาร์โค้ดในการระบุชนิดพืชในวงศ์เหงือกปลาหมอ (Acanthaceae) ในประเทศไทย

Abstract

การระบุชนิดพืชสมุนไพรให้ถูกต้องมีความสำคัญมากในการควบคุมและตรวจสอบคุณภาพของผลิตภัณฑ์สมุนไพร ในการศึกษานี้ได้นำเอาหลักการของดีเอ็นเอบาร์โค้ดมาใช้ในการระบุชนิดพืชวงศ์เหงือกปลาหมอที่พบในประเทศไทยและประยุกต์ใช้ในการตรวจสอบผลิตภัณฑ์สมุนไพรจากพืชวงศ์เหงือกปลาหมอที่พบในท้องตลาด โดยในงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาและรวบรวมพืชวงศ์เหงือกปลาหมอในประเทศไทยได้ทั้งหมด 24 สกุล 58 ชนิด ทำการสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอโดยสามารถสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอได้จากพืชทุกตัวอย่าง แล้วทำการศึกษาดีเอ็นเอบาร์โค้ด 3 ตำแหน่ง ได้แก่ internal transcri-bed spacer 2 (ITS2), psbA-trnH และ trnL-trnF intergenic spacers พบว่า การเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอบริเวณ ITS2 ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาดประมาณ 500 คู่เบส มีค่าความส าเร็จร้อยละ 93.1 ส่วนดีเอ็นเอบริเวณ psbA-trnH และ trnL-trnF มีขนาดประมาณ 450-500 คู่เบส และ 450 คู่เบส ตามลำดับ โดยมีความสำเร็จร้อยละ 89.7 ทั้งสองบริเวณ นำเอาข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ที่อ่านได้และตรวจสอบความถูกต้องด้วยโปรแกรม Bioedit เวอร์ชั่น 7.0.8.0 บันทึกไว้ในฐานข้อมูล Genbank โดยร้อยละความส าเร็จในการอ่านล าดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอบริเวณ ITS2 มีค่า 83.0 ส่วนบริเวณ psbA-trnH และ trnL- trnF มีค่า 86.5 ทั้งสองบริเวณ เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์แล้วพบว่าตำแหน่ง ITS2 มีความยาวเฉลี่ย 225±17.4 คู่เบส และมีปริมาณ GC เฉลี่ยร้อยละ 63.1±3.8 ต าแหน่ง psbA-trnH มีความยาวเฉลี่ย 362±85.8 คู่เบส และมีปริมาณ GC เฉลี่ยร้อยละ 31.5±1.9 และตำแหน่ง trnL-trnF มีความยาวเฉลี่ย 335±22.8 คู่เบส และมีปริมาณ GC เฉลี่ยร้อยละ 40.2±1.1 เมื่อทำการเปรียบเทียบ ค่า K2P distance ด้วยโปรแกรม MEGA เวอร์ชั่น 6.06 ระหว่างชนิดพืชในตัวอย่างพืช 3 สกุล ได้แก่ Barleria, Justicia และ Thunbergia พบว่าดีเอ็นเอตำแหน่ง ITS2 มีความแตกต่างมากที่สุดโดยมีค่า K2P distance เฉลี่ย 0.427 ส่วนตำแหน่ง psbA-trnH และ trnL-trnF มีค่า 0.098 และ 0.053 ตามลำดับ แสดงให้เห็นว่าดีเอ็นเอบริเวณ ITS2 มีความเหมาะสมที่สุดในการใช้เป็นดีเอ็นเอบาร์โค้ดในการระบุชนิดพืชวงศ์เหงือกปลาหมอ และเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการระบุชนิดพืชวงศ์นี้ให้มากขึ้นจึงเสนอให้ใช้ดีเอ็นเอตำแหน่ง ITS2 และ psbA-trnH ร่วมกัน นอกจากนั้นเมื่อนำเอาฐานข้อมูลดีเอ็นเอบาร์โค้ดทั้ง 3 ตำแหน่งมาประยุกต์ใช้ในการตรวจสอบผลิตภัณฑ์สมุนไพรรางจืดที่พบในท้องตลาด พบว่าฐานข้อมูลดีเอ็นเอบาร์โค้ดที่จัดทำขึ้นสามารถใช้ในการระบุชนิดผลิตภัณฑ์ดังกล่าวได้ Accurate identification of plants is essential for quality control of herbal medicines. In this study, DNA barcoding was used to identify plants in the family Acanthaceae and some of their herbal products. Fifty-eight species from 24 genera belonging to this family found in Thailand were collected. Genomic DNA was successfully extracted from every specimen. Three DNA regions, internal transcribed spacer 2 (ITS2), psbA-trnH and trnL-trnF intergenic spacers were evaluated as DNA barcode candidates. Upon PCR amplification, fragments of ITS2, psbA-trnH and trnL-trnF were 500, 450-500, and 450 base pairs, respectively. Success rate of PCR amplification of ITS2, psbA-trnH and trnL-trnF were 93.1%, 89.7% and 89.7%, respectively, whereas sequencing efficiency were 83.0%, 86.5%, and 86.5%, respectively. Sequences were verified via Bioedit version 7.0.8.0 and deposited in GenBank. It was found that average sizes of ITS2, psbA-trnH, and trnL-trnF were 225±17.4, 362±85.8, and 335±22.8 base pairs, respectively, while average GC contents were 63.1±3.8, 31.5±1.9, and 40.2±1.1 %, respectively. Kimura-2 parameter distances between pairs of species of Barleria, Justicia, and Thunbergia, which represent interspecific divergence, were calculated using MEGA version 6.06. The average K-2P of ITS2, psbA-trnH, and trnL-trnF were 0.427, 0.098, and 0.053, respectively. The results showed that ITS2 was the most variable and the best DNA barcode candidate amongst the 3 studied regions. Combination use of ITS2 and psbA-trnH will improve discrimination power and could be potential barcodes for identification of Acanthaceae. Those 3 studied sequences were successfully applied to identify unknown Thunbergia laurifolia Lindl. crude drugs purchased from markets.