การปรับปรุงกระบวนการผลิตเจนิพินและการประยุกต์ใช้สำหรับวิเคราะห์ยาและตรึงเอนไซม์

Abstract

เจนิพินเป็นสารในกลุ่มอิริดอยด์อะไกลโคนที่พบได้ในผลของพืชตระกูลพุด และถูกนำมาใช้เป็นสีผสมอาหาร สีย้อมผ้า และสารเชื่อมขวางสำหรับหมู่เอมีน รวมทั้งมีรายงานว่ามีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย ได้แก่ ต้านการอักเสบ ต้านมะเร็ง ต้านเชื้อรา และปกป้องเซลล์สมอง อย่างไรก็ตาม ในธรรมชาติพบเจนิพินในปริมาณต่ำ แต่พบเจนิโพไซด์ซึ่งเป็นสารในรูปไกลโคไซด์ในปริมาณที่มากกว่า ดังนั้นการสกัด เจนิพินต้องใช้หลายขั้นตอน ซึ่งใช้เวลานานและสิ้นเปลืองสารเคมี ประกอบด้วยการเริ่มต้นสกัดจากพืช การแยกเจนิโพไซด์และการทำให้บริสุทธิ์ และขั้นตอนสุดท้ายโดยการไฮโดรไลซิสเจนิโพไซด์เพื่อเปลี่ยนเป็นเจนิพิน ในการศึกษานี้ศึกษาการผลิตเจนิพินโดยตรงจากผลพุดโดยนำเอนไซม์เซลลูเลส มาทำให้ผนังเซลล์พืชแตกออก ซึ่งสามารถเพิ่มการปลดปล่อยสารเจนิโพไซด์ออกจากผลพุดได้อย่างมีประสิทธิภาพ และเพื่อกำจัดหมู่น้ำตาลออกจากโครงสร้างของเจนิโพไซด์ พร้อมกับการใช้เอทิลอะซีเตทเป็นตัวทำละลายในการสกัดแยกเจนิพินมาสู่วัฏภาคอินทรีย์ ซึ่งช่วยผลักดันปฏิกิริยาให้เข้าสู่สมดุล และได้ผลิตภัณฑ์ที่มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น โดยวิธีดังกล่าว สามารถเตรียมเจนิพินได้ 58.83 มิลลิกรัม จากผลพุดแห้ง 1 กรัม ในด้านการนำมาประยุกต์ใช้ทางด้านเภสัชกรรม เจนิพินถูกนำมาใช้เป็นสารก่อสีสำหรับวิเคราะห์หาปริมาณยา ได้แก่ กาบาเพนติน และเป็นสารเชื่อมขวางสำหรับการตรึงเอนไซม์ สำหรับการวิเคราะห์หาปริมาณกาบาเพนติน อาศัยการทำปฏิกิริยาระหว่างเจนิพินกับหมู่เอมีนปฐมภูมิของตัวยา ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์ที่มีสีน้ำเงิน ปฏิกิริยาเกิดขึ้นโดยผสมสารละลายกาบาเพนตินกับเจนิพินที่มีความเข้มข้น 2 มิลลิโมลาร์ ที่ค่าพีเอช 7 จากนั้นนำไปให้ความร้อนที่ 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วนำสารละลายที่ได้ไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 590 นาโนเมตร พบว่าวิธีนี้มีความสัมพันธ์เป็นเส้นตรงที่ดีมาก เมื่อใช้ในการวิเคราะห์หาปริมาณกาบาเพนตินในช่วงความเข้มข้น 0.15-0.50 มิลลิโมลาร์ มีความถูกต้อง แม่นยำ และมีความจำเพาะ โดยไม่ถูกรบกวนจากสารเจือปนที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกับตัวยาและสารปรุงแต่งที่อยู่ในตำรับ วิธีนี้ทำให้เกิดสีที่มีความคงตัวดี และสามารถวิเคราะห์หาปริมาณตัวยาได้ไม่แตกต่างจากวิธีโครมาโทกราฟีชนิดของเหลวสมรรถนะสูงซึ่งเป็นวิธีที่เภสัชตำรับกำหนด นอกจากนี้ในงานวิจัยยังได้ออกแบบกรรมวิธีบำบัดของเสียที่เกิดขึ้น โดยใช้แร่ยิปซั่มมาดูดซับสีและสารต่างๆ ในสารละลายของเสีย ซึ่งพบว่าของเสียที่ผ่านการบำบัดแล้วนั้นมีความปลอดภัยต่อสิ่งมีชีวิตที่นำมาใช้ทดสอบ ได้แก่ ไรกุ้งและปลาหางนกยูง จากการที่เจนิพิน 1 โมเลกุลสามารถทำปฏิกิริยากับหมู่เอมีนได้ 2 หมู่ ในงานวิจัยจึงนำเจนิพินมาใช้เป็นสารเชื่อมขวางเพื่อตรึงเอนไซม์เบต้ากลูโคซิเดสบนเม็ดไคโตซาน โดยศึกษาลำดับการผสมที่แตกต่างกันรวมทั้งปัจจัยที่ส่งผลต่อปฏิกิริยาการเชื่อมขวาง พบว่าการตรึงเอนไซม์เบต้ากลูโคซิเดสบนเม็ดไคโตซาน โดยผสมเอนไซม์เบต้ากลูโคซิเดสที่มีความเข้มข้น 0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร กับเจนิพินที่มีความเข้มข้นร้อยละ 0.1 เข้ากับเม็ดไคโตซานที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ให้เอนไซม์ในรูปตรึงที่มีการทำงานของเอนไซม์ที่ดีที่สุด และมีความคงตัวต่ออุณหภูมิและพีเอชที่ดีกว่าเอนไซม์ในรูปอิสระและเอนไซม์ที่ถูกตรึงอยู่บนเม็ดไคโตซานที่ถูกเชื่อมขวางด้วยกลูตารัลดีไฮด์ เมื่อทดสอบประสิทธิภาพในการใช้ซ้ำโดยใช้ p-NPG เป็นสารตั้งต้น เอนไซม์ที่ถูกตรึงบนเม็ดไคโตซานมีความสามารถในการใช้ซ้ำที่ดี โดยมีค่าการทำงานของเอนไซม์ร้อยละ 80 หลังจากผ่านการใช้งานไป 10 ครั้ง นอกจากนี้ยังสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการไฮโดรไลซ์หมู่น้ำตาลที่อยู่บนโครงสร้างไกลโคไซด์ที่มีชื่อว่าเจนิสติน และเปลี่ยนเป็นเจนิสเตอิน ซึ่งเป็นสารที่มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา โดยเอนไซม์ในรูปตรึงมีสมบัติในการใช้ซ้ำ โดยยังมีการทำงานของเอนไซม์ร้อยละ 70 หลังจากผ่านการใช้งานไป 5 ครั้ง เมื่อเทียบกับการใช้งานในครั้งแรก นอกจากนี้เอนไซม์ในรูปตรึงนี้ยังคงความสามารถในการทำงานของเอนไซม์มากกว่าร้อยละ 90 หลังจากเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วัน

Genipin is an iridoid aglycone found in fruit of Gardenia jasminoides Ellis. It has been used as food colorant, fabric dye and amine cross-linker and has been reported for several pharmacological activities such as anti-inflammation, anti-cancer, anti-fungal and neuroprotective. However, genipin is naturally present at a low concentration while its glycoside counterpart namely geniposide occurs more abundantly. Genipin is usually obtained by multi-step, time- and reagent-consuming preparation consisting of the initial extraction of plant materials, fractionation and purification of geniposide and final hydrolysis of geniposide to genipin. In this study, a direct route for the production of genipin was investigated by using cellulase as a single enzyme to disrupt plant cell wall for the efficient release of geniposide as well as to cleave off the sugar moiety from geniposide. Simultaneously, ethyl acetate was added as an extractant to extract genipin in situ into the organic phase, thus helping to drive the reaction equilibrium and obtain the product with the enhanced purity. Via this approach, the yield was achieved at 58.83 mg genipin starting from 1 g of the dry plant. In the aspect of pharmaceutical applications, genipin was used in this study as a colorimetric reagent for the analysis of drugs i.e. gabapentin, and as a cross-linker for enzyme immobilization. For the assay of gabapentin, the principle relied on the formation of blue product once genipin reacted with the primary amine group of gabapentin. The reaction was setup by mixing the solutions of gabapentin and 2 mM genipin solution at pH 7, followed by heating at 80 ºC for 1 h. Then, the absorbance values of the resultant solutions were measured spectrophotometrically at 590 nm. The proposed method showed an excellent linearity in the range of 0.15-0.50 mM gabapentin. It was accurate, precise and insensitive to the interferences from related impurities and common excipients. The method produced stable blue color and provided the assay results in agreement with the pharmacopeial HPLC method. Beyond the assay development, the treatment of waste from the laboratory was also designed based on the use of gypsum as an adsorbent. After the treatment, the blue product was dramatically removed from the waste solution and the treated waste was proven to be safe for tested aquatic organisms i.e. brine shrimps and guppy fishes. Since one molecule of genipin can react with two amine groups, it was used in this study to cross-link β-glucosidase with chitosan beads aimed for enzyme immobilization. Several methods with different mixing orders as well as parameters in the cross-link reaction were studied. It was found that the preparation of immobilized chitosan beads by mixing 0.5 mg/mL β-glucosidase with 0.1% genipin at 40 °C for 6 h showed the highest enzyme activity. By this approach, the immobilized enzyme showed greater pH and thermal stability than free enzyme and those prepared by using glutaraldehyde. The immobilized beads were tested for the reusability by using p-NPG as a substrate. The results showed that it still had the activity higher than 80% of its activity after 10 cycles used. Moreover, the immobilized beads were applied to hydrolyze a glycoside, namely genistin, and convert to genisetin which has the pharmacological activities. It showed a satisfactory reusability, retaining more than 70% of its activity after 5 cycles used. In addition, the residual activity of the cross-linked and immobilized chitosan beads remained more than 90% of its initial value after storage at 4 °C for 30 days.