Application of microneedles and electroporation for antigen delivery to enhance the efficiency of skin vaccination

Abstract

In this study, the effect of different transdermal drug delivery methods, including solid microneedles (MNs) patch (poke and patch approach), electroporations (EPs) patch, solid MNs+EPs patch, and hollow MN (poke and flow approach) on ovalbumin (OVA) or plasmid DNA encoding ovalbumin (pOVA) were evaluated to enhance skin permeation and skin immunization. OVA and pOVA, hydrophilic macromolecules, were selected as model antigen because they can generate the immune responses, whereas they have characteristically poor skin permeation. The in vivo immune responses of OVA at different concentrations and pOVA complexes with different cationic nanocarriers using the best physical enhancement method compared with subcutaneous injection were also investigated. For enhancing of skin permeation and skin immunization of OVA, different types of MNs and doses of OVA antigen were used for in vitro skin permeation and in vivo immunization. In vitro skin permeation experiments and confocal laser scanning microscopy (CLSM) study revealed that hollow MN had a superior enhancing effect on skin permeation compared with a solid MNs patch and untreated skin by efficiently delivering ovalbumin-fluorescein conjugate (OVA-F) into the deep skin layers. The flux and cumulative amount of OVA-F at 8 h after administering with different types of MNs could be ranked as follows; high dose of OVA-F (500 μg) > medium dose (250 μg) > low dose (100 μg), moreover, the use of hollow MN showed a superior enhancing effect compared with the solid MNs patch. When the hollow MN was used for the delivery of OVA into the skin of BALB/c mice, it was capable of inducing a stronger immunoglobulin G (IgG) immune response than subcutaneous injection at the same antigen dose. IgG levels in the hollow MN group were 5.7, 11.6, and 13.3 times higher than those of the subcutaneous injection group for low, medium, and high doses, respectively. Furthermore, the mice immunized using the hollow MN showed no signs of skin infection or pinpoint bleeding. The results suggest that the hollow MN is an efficient device for delivering the optimal dose of antigen via the skin for successful immunization. For a combined approach of hollow MN and cationic nanocarriers for skin immunization with pOVA, the use of different types of MNs and nanocarriers for in vitro skin permeation and in vivo immunization of pOVA was investigated. In vitro skin permeation studies indicated that hollow MN had a superior enhancing effect on skin permeation compared with the combination of MNs and EPs patch, solid MNs patch, EPs patch, respectively. Upon using hollow MN combined with cationic nanocarriers for pOVA delivery, the skin permeation was higher than the delivery of naked pOVA, as evidenced by the increased flux of pOVA. When the hollow MN was used for the delivery of nanocarrier/pOVA complexes into the skin of mice, they induced a stronger IgG immune response than subcutaneous injection. Regarding to safety issues, immunization of mice with the hollow MN are safe. Accord­ingly, the hollow MN combined with a nanocarrier delivery system is a promising approach for delivering pOVA complexes to the skin for promoting successful skin immunization.

การศึกษานี้เป็นการประเมินผลของเทคนิคการนำส่งยาทางผิวหนัง ได้แก่ แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ของแข็ง (เทคนิคแทงและแปะ) แผ่นแปะอิเล็กโทรพอเรชั่น แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ของแข็งร่วมกับอิเล็กโทรพอเรชั่น และไมโครนีเดิลส์กลวง (เทคนิคแทงและไหล) ต่อการเพิ่มประสิทธิภาพการนำส่งโอวัลบูมินและพลาสมิดโอวัลบูมินและการเสริมสร้างภูมิคุ้มกันทางผิวหนัง โดยได้เลือกใช้โอวัลบูมินและพลาสมิดโอวัลบูมินเป็นแอนติเจนต้นแบบเนื่องจากเป็นสารโมเลกุลใหญ่ชอบน้ำ และกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันได้ แต่การซึมผ่านผิวหนังต่ำ การศึกษานี้ได้ประเมินการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในสัตว์ทดลองของโอวัลบูมินความเข้มข้นต่างกัน รวมถึงสารประกอบเชิงซ้อนระหว่างพลาสมิดโอวัลบูมินและชนิดของตัวพาอนุภาคขนาดนาโนประจุบวกที่แตกต่างกัน โดยใช้เทคนิคการเพิ่มการนำส่งทางกายภาพที่มีประสิทธิภาพดีที่สุดเปรียบเทียบกับการฉีดเข้าชั้นใต้ผิวหนัง ผลการศึกษาการเพิ่มการซึมผ่านและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทางผิวหนังของโอวัลบูมินโดยใช้ไมโครนีเดิลส์ต่างชนิดกัน และใช้โอวัลบูมินปริมาณต่างกันในหลอดทดลองและภาพจากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดใช้เลเซอร์ในการสแกน พบว่าการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงเพิ่มประสิทธิภาพการนำส่งโอวัลบูมินติดสีฟลูออเรสซีนโดยซึมผ่านผิวหนังได้ลึกกว่าการใช้แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ของแข็ง หลังจากการทดสอบเป็นเวลา 8 ชั่วโมง พบว่าค่าฟลักซ์และปริมาณการสะสมของโอวัลบูมินติดสีฟลูออเรสซีนเรียงลำดับได้ดังนี้ โอวัลบูมินปริมาณสูง (500 ไมโครกรัม) > กลาง (250 ไมโครกรัม) > ต่ำ (100 ไมโครกรัม) และการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงมีค่าฟลักซ์สูงกว่าการใช้แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ของแข็ง ดังนั้นจึงใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงเพื่อนำส่งโอวัลบูมินทางผิวหนังในหนู BALB/c พบว่าสามารถเหนี่ยวนำการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันชนิดอิมมูโนโกลบูลินจีได้สูงกว่าการฉีดเข้าชั้นใต้ผิวหนังเมื่อให้แอนติเจนที่ปริมาณเท่ากัน โดยระดับของอิมมูโนโกลบูลินจีในกลุ่มหนูที่ใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงมีค่าสูงกว่ากลุ่มหนูที่ฉีดเข้าชั้นใต้ผิวหนังถึง 5.7, 11.6 และ 13.3 เท่า สำหรับขนาดแอนติเจนสูง กลาง และต่ำ ตามลำดับ หนูที่ได้รับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงไม่พบการติดเชื้อที่ผิวหนังหรือจุดเลือดออก ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่าการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงกับขนาดของแอนติเจนที่พอเหมาะโดยให้ทางผิวหนังสามารถสร้างภูมิคุ้มกันได้ ส่วนการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงร่วมกับตัวพาอนุภาคขนาดนาโนประจุบวกเพื่อเสริมสร้างภูมิคุ้มกันทางผิวหนังด้วยพลาสมิดโอวัลบูมิน โดยศึกษาผลของไมโครนีเดิลส์และตัวพาอนุภาคขนาดนาโนประจุบวกที่ต่างกันต่อการซึมผ่านพลาสมิดโอวัลบูมิน ทางผิวหนังในหลอดทดลอง และการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในสัตว์ทดลอง ผลการศึกษาการซึมผ่านผิวหนังพบว่าการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงมีประสิทธิภาพในการช่วยเพิ่มการนำส่งพลาสมิดโอวัลบูมินได้ดีกว่าการใช้แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ของแข็งร่วมกับอิเล็กโทรพอเรชั่น แผ่นแปะไมโครนีเดิลส์ชนิดเข็มตัน แผ่นแปะอิเล็กโทรพอเรชั่น ตามลำดับ สำหรับการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงร่วมกับการใช้ตัวพาอนุภาคขนาดนาโนประจุบวกเพื่อนำส่งพลาสมิดโอวัลบูมินพบว่าค่าฟลักซ์สูงกว่าไม่มีตัวพาอนุภาคขนาดนาโนประจุบวก การเสริมสร้างภูมิคุ้มกันทางผิวหนังด้วยพลาสมิดโอวัลบูมินเมื่อใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงในการนำส่งพบว่าสามารถเหนี่ยวนำระดับของอิมมูโนโกลบูลินจีได้มากกว่าการฉีดเข้าชั้นใต้ผิวหนัง สำหรับในเรื่องประเด็นความปลอดภัยพบว่าการเสริมสร้างภูมิคุ้มกันทางผิวหนังในหนูโดยใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงมีความปลอดภัย ดังนั้นการใช้ไมโครนีเดิลส์กลวงร่วมกับตัวพาอนุภาคขนาดนาโนเป็นเทคนิคที่ดีสำหรับนำส่งสารประกอบเชิงซ้อนพลาสมิดโอวัลบูมินเข้าสู่ผิวหนังเพื่อส่งเสริมให้การสร้างภูมิคุ้มกันทางผิวหนังประสบความสำเร็จ