Development of automatic, rapid and economic methods for evaluation of antioxidant capacity using flow injection analysis

Abstract

This work presents the development of automatic, rapid and economic methods for evaluation of total antioxidant capacity (TAC) which consists of two parts. The first part describes a rapid method for generation of ABTS radical cation (ABTS•+) using electrochemical technique. Due to the conventional chemical generation is time-consuming which requires 12-16 hrs. Using the electrochemical technique, the generation time was reduced to 10 minutes. To produce the ABTS•+ electrochemically, a wire platinum was used as a cathode, immersing in zinc acetate solution, and a platinum coil was used as an anode, immersing in ABTS solution. A constant current was applied. Then, ABTS•+ was produced at the anode. Some parameters were optimized with respect to applied current, generation time, supporting electrolyte and ABTS concentration. Under the optimum condition, the blue-green color of ABTS•+ was appeared and the maximum absorbance at 734 nm of about 0.7 was achieved. The ABTS•+ solution obtained from our method was used to evaluate the TAC by a flow injection analysis (FIA) system. Upon reaction with an antioxidant, the blue-green color of ABTS•+ was diminished and monitored by a UV-Vis spectrophotometer. The sample analysis results obtained from our method was comparable to the results obtained from the conventional batch method with the ABTS•+ chemical generation. In the second part, a simple colorimeter based on Paired Emitter-Detector Diodes (PEDD) was constructed as a detection device in the FIA system for evaluation of TAC instead of using the common spectrophotometer. The PEDD consists of two light emitting diodes (LEDs), which are LED-emitter and LED-detector. Some parameters affected the analytical performance were investigated including, color of LED, flow rate and injection volume. At the optimum condition, the PEDD furnished with the FIA system was employed for evaluation of TAC using ABTS, DPPH and FRAP assays, separately. Moreover, the TAC can be simultaneous analysis using the FIA with a 10-port valve and two PEDD devices. The TAC was measuring using the ABTS and FRAP assay in parallel. The developed method was applied to the measurement of TAC of commercial fruit juice, instant tea product and vitamin C tablet using ascorbic acid as a standard antioxidant. The ascorbic acid equivalent values (AAC) from our method were not significantly different from the reference batch methods with spectrophotometric detection. Moreover, a lab-made flow cell and a prototype of handheld colorimeter were also fabricated. Preliminary results show that the fabricated flow cell and the handheld colorimeter can be used for antioxidant assays. However, further experiments for testing of repeatability and stability should be investigated

งานวิจัยนี้ได้พัฒนาวิธีอัตโนมัติ รวดเร็ว และราคาถูก สำหรับประเมินความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวม โดยประกอบด้วย 2 ส่วนหลักคือ 1) การศึกษาการผลิตอนุมูลอิสระ ABTS•+ ที่รวดเร็วโดยอาศัยวิธีทางเคมีไฟฟ้า 2) การพัฒนาอุปกรณ์ตรวจวัดสีของสารละลายโดยอาศัยหลักการพีอีดีดี (Pair Emitter-Detector Diodes, PEDD) ไปใช้ประเมินความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวมแทนเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ด้วยวิธี ABTS วิธี DPPH และวิธี FRAP โดยงานส่วนที่หนึ่ง ได้พัฒนาวิธีการผลิตอนุมูลอิสระ ABTS•+ ที่รวดเร็วกว่าวิธีดั้งเดิม โดยอาศัยวิธีทางเคมีไฟฟ้า ซึ่งใช้เวลาแค่ 10 นาที ในการเปลี่ยน ABTS ไปเป็น ABTS•+ โดยใช้ลวดแพลทินัมแบบตรงเป็นขั้วแคโทด จุ่มอยู่ในสารละลาย zinc acetate และลวดแพลทินัมแบบเกลียวคล้ายสปริงเป็นขั้วแอโนดจุ่มอยู่ในสารละลาย ABTS เมื่อให้กระแสไฟฟ้าคงที่แก่ขั้วไฟฟ้าทั้งสอง ด้านแอโนดจะเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันเปลี่ยน ABTS ให้เป็นอนุมูลอิสระ ABTS•+ ผู้วิจัยศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อการผลิตสารละลาย ABTS•+ ได้แก่ ความเข้มของกระแสไฟฟ้า เวลาที่จ่ายกระแสไฟฟ้า ความเข้มข้นและชนิดของสารละลาย supporting electrolyte และความเข้มข้นของสารละลาย ABTS พบว่าในสภาวะที่เหมาะสมจะได้สารละลาย ABTS•+ ที่มีสีเขียวน้ำเงินและมีค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 734 nm เท่ากับ 0.7 และนำสารละลาย ABTS•+ ที่ผลิตได้ไปใช้ในการประเมินความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวมด้วยระบบการไหลโฟลอินเจคชันอะนาลิซิส พบว่าเมื่ออนุมูลอิสระ ABTS•+ ทำปฏิกิริยากับสารต้านออกซิเดชัน จะทำให้ปริมาณของ ABTS•+ ลดลง สีของสารละลาย ABTS•+ จะจางลง ซึ่งสามารถติดตามวัดการดูดกลืนแสงของสารละลาย ABTS•+ ที่ลดลงด้วยเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ และเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์สารต้านออกซิเดชันของวิธีการผลิตอนุมูลอิสระ ABTS•+ ด้วยวิธีทางไฟฟ้าที่พัฒนาขึ้นกับวิธีการผลิตอนุมูลอิสระแบบดั้งเดิมด้วยวิธีการใช้สารเคมี พบว่าผลการวิเคราะห์มีค่าไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ งานวิจัยส่วนที่สองเป็นการพัฒนาอุปกรณ์ตรวจวัดสีของสารละลายโดยอาศัยหลักการพีอีดีดี (PEDD) ซึ่งใช้หลอดไดโอดเปล่งแสงหรือหลอดไฟแอลอีดี (Light emitting diode, LED) ทำหน้าที่เป็นทั้งแหล่งกำเนิดแสงและเป็นตัวรับแสง และนำอุปกรณ์พีอีดีดีที่สร้างขึ้นไปใช้เป็นเครื่องตรวจวัดสำหรับระบบการไหลที่พัฒนาขึ้นในการประเมินความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวม ด้วยวิธี ABTS วิธี DPPH และวิธี FRAP ทดแทนการใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ซึ่งมีราคาแพง และศึกษาปัจจัยต่างๆ ที่ส่งผลต่อวิธีวิเคราะห์ ได้แก่ สีของหลอดแอลอีดี อัตราการไหลของสารละลาย และปริมาตรสารตัวอย่าง อีกทั้งยังพัฒนาระบบการไหลด้วยวิธีวิเคราะห์แบบ ABTS และแบบ FRAP ไปพร้อมกันเพื่อประเมินความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวม โดยใช้อินเจคชั่นวาล์วแบบ 10-port และเครื่องตรวจวัดชนิดพีอีดีดี 2 เครื่อง และนำระบบที่พัฒนาขึ้นไปประยุกต์ใช้ในการวิเคราะห์ตัวอย่างน้ำผลไม้ เครื่องดื่มสมุนไพร และวิตามินซีแบบเม็ด โดยรายงานเป็นค่า Ascorbic acid equivalent (AAE) เปรียบเทียบกับการวิเคราะห์แบบ batch ซึ่งเป็นวิธีอ้างอิง พบว่ามีค่าไม่ต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ผู้วิจัยยังได้สร้างโฟลเซลล์จากอะคริลิค และสร้างเครื่องต้นแบบคัลเลอริมิเตอร์แบบพกพาโดยอาศัยหลักการของพีอีดีดีอีกด้วย ผลการทดลองเบื้องต้นพบว่าสามารถใช้งานได้ อย่างไรก็ตามต้องศึกษาความสามารถในการทำซ้ำของโฟลเซลล์ และความเสถียรของเครื่องคัลเลอริมิเตอร์นี้ต่อไป