Safety Assessment of Blood Bags Using Animal Cell Culture

Abstract

Blood bag is a medical device that must be safe and be acceptable according to the standard for clinical used. The imported blood bags from oversea should pass the safety assessment of ISO 10993-5 or the guideline from public health ministry and TIS 1298-2555. This study aimed to investigate the safety of quadruple blood bags from 3 manufacturers (Vietnam, India and Japan). The safety test was performed according to ISO 10993-5 emphasizing on acute cytotoxicity assay, subchronic assay, chronic assay and genotoxicity assay using mouse fibroblast L929 cell line. Acute toxicity assay revealed that all blood bag materials demonstrated toxicity at level 1 (slight) and 2 (mild) based on agar diffusion and direct contact assay, respectively. Cells contacted with extract samples also exhibited cell viability more than 70% from all 3 tested samples using MTT assay and cell morphology revealed toxicity at level 2 (mild) at the sample concentration of 0.2 g/ml. This demonstrated that blood bag materials of 3 sample sources were no cytotoxic. The subchronic and chronic assay were performed under simulation on the actual use of blood bags, medium represented as blood was feed into blood bag and the collected samples from bags of red blood cell and platelet were tested on cell viability using MTT assay. The cell morphology after extract samples incubation for 24 hr revealed toxicity grade at level 1 (slight) with cell viability greater than 70% at the sample concentration of 1:5 fold of sample. Subchronic and chronic toxicology assay were also performed using colony forming assay. The cell revealed percentage of plating efficiency at more than 70% after exposure to samples at the sample concentration of 1:5 fold of solution, for 1 or 2 repetitive treatment. This implied that repeated use of blood bags has no effect on cell growth. The genotoxicity of the samples were performed using micronuclei assay. All test condition provided NDI> 1, implying cell undergo proliferation in cell cycle. The frequency of micronuclei from cell exposured to sample was lower than that exposured to colchicine. It can be concluded from all results that all tested blood bags meet acceptable safety criteria according to the TIS 1298-2555 and ISO 10993-5.

ถุงบรรจุโลหิตเป็นอุปกรณ์การแพทย์ที่ต้องมีความปลอดภัยและมีมาตรฐานเป็นที่ยอมรับได้ ซึ่งการนำเข้าถุงบรรจุโลหิตจากต่างประเทศต้องผ่านการประเมินความปลอดภัยตามมาตรฐาน มอก.1298-2555 มาตรฐาน ISO 10993 หรือมาตรฐานอื่นๆ ที่เทียบเท่า การศึกษาวิจัยนี้เป็นการประเมินความปลอดภัยทางชีวภาพของถุงบรรจุโลหิตชนิด 4 ถุง ซึ่งผลิตในประเทศเวียดนาม อินเดีย และญี่ปุ่น ด้วยการตรวจสอบความเป็นพิษตามมาตรฐาน ISO 10993-5 ประกอบด้วยความเป็นพิษเฉียบพลัน ความเป็นพิษแบบกึ่งเรื้อรังและเรื้อรัง และความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมโดยใช้เซลล์สัตว์เพาะเลี้ยง (L929) ผลการตรวจสอบความเป็นพิษเฉียบพลันของตัวอย่างวัสดุถุงบรรจุโลหิต พบว่าตัวอย่างจากทั้ง 3 แหล่งผลิตมีความเป็นพิษระดับที่ 1 (พิษน้อยมาก) และระดับที่ 2 (พิษน้อย) ในการวิเคราะห์ด้วย agar diffusion และ direct contact ตามลำดับ และจากลักษณะสัณฐานของเซลล์ที่สัมผัสกับสารสกัดจากวัสดุที่ความเข้มข้นของสารตัวอย่าง 0.2 g/ml ในวิธี MEM elution มีความเป็นพิษระดับที่ 2 (พิษน้อย) และให้ค่าความมีชีวิตของเซลล์มากกว่า 70 % เมื่อวิเคราะห์ด้วยวิธี MTT assay แสดงถึงวัสดุบรรจุโลหิตจาก 3 แหล่งผลิตไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ในการวิเคราะห์แบบเฉียบพลัน ส่วนการตรวจสอบความเป็นพิษแบบกึ่งเรื้อรังและเรื้อรัง ใช้สภาวะจำลองการใช้งานจริงของถุงบรรจุโลหิต โดยแทนโลหิตด้วยสารละลายอาหารเลี้ยงเซลล์ แล้วนำตัวอย่างจากเกล็ดเลือดและถุงบรรจุเม็ดเลือดแดงไปศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ด้วยการดูลักษณะสัณฐานของเซลล์แล้ววัดความมีชีวิตด้วยวิธี MTT assay พบว่าลักษณะสัณฐานของเซลล์ที่สัมผัสกับสารตัวอย่างเป็นเวลา 24 ชั่วโมง มีพิษระดับที่ 1 (พิษน้อยมาก) และมีค่าความมีชีวิตของเซลล์มากกว่า 70 % ของสารตัวอย่างที่ความเข้มข้นเจือจางเป็น 1:5 ผลตรวจวัดพิษแบบกึ่งเรื้อรังและเรื้อรังด้วยวิธี colony forming assay พบว่าสารละลายอาหารจากถุงบรรจุโลหิตในสภาวะจำลองการใช้งานจริงมีผลให้เซลล์ที่สัมผัสมี % Plating efficiency มากว่า 70% จากการบ่มเซลล์กับสารตัวอย่างที่ความเข้มข้นเจือจาง 1:5 จำนวน 1 ครั้งและ 2 ครั้งต่อเนื่องกัน แสดงถึงการใช้ถุงบรรจุโลหิตไม่ส่งผลกระทบต่อการเจริญของเซลล์จากการได้รับสารจากถุงบรรจุโลหิตซ้ำๆ การตรวจสอบความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมของตัวอย่างด้วยวิธี micronuclei assay พบว่าทุกสภาวะให้ค่า NDI มากกว่า 1 แสดงถึงประชากรเซลล์มีการแบ่งตัวผ่านวัฏจักรเซลล์ ส่วนค่าความถี่ของการเกิด micronuclei ในเซลล์ที่ได้รับตัวอย่างถุงเลือดมีค่าระดับต่ำกว่า colchicine ซึ่งเป็นตัวควบคุมบวกอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้นจากผลทั้งหมดที่ได้นี้ อาจกล่าวได้ว่าถุงบรรจุโลหิตที่เป็นตัวอย่างในการศึกษานี้มีความปลอดภัยตามเกณฑ์ของมาตรฐาน มอก.1298-2555 และมาตรฐาน ISO 10993