Synthesis and Cytotoxicity Towards Cancer Cell Lines of Sorafenib Derivatives with Triazole as a Core Structure

Abstract

Sorafenib is the first drug approved by the Food and Drug Administration of the United States (US FDA) for treatment of advanced liver. Later, it was approved for the treatment of advanced kidney, and thyroid cancers. Sorafenib inhibits various kinases, in particular B-Raf and VEGFR-2. However, sorafenib has low bioavailability and many side effects. This research aimed to synthesize new sorafenib derivatives which the core phenoxy and picolinamide ring of sorafenib were replaced with a 1,2,3-triazole ring linked with a substituted aromatic ring. Forty-nine analogues were synthesized successfully via nucleophilic addition and 1,3-dipolar cycloaddition with excellent yields (The preliminary results of 13 analogues were reported previously in my undergraduate thesis).

Their inhibitory properties of HepG2 liver cancer cells, A549 lung cancer cells, HuCCA-1 gallbladder cancer cells, MOLT-3 and HL-60 blood cell carcinoma cells, and T47-D and MDA-MB-231 breast cancer cells were investigated by MTT and XTT assays. It was found that the sorafenib derivatives expressed excellent inhibitory effects on HepG2 liver cancer cells and T47-D breast cancer cells, whereas they showed moderate to poor inhibitory activities against other tested cell lines. Among the synthetic derivatives, compounds 12e (R = o-Cl), 12y (R = p-CF3), 12i’ (R = o-isopropyl), and 12m’ (R = p-t-Bu) exhibited best inhibitory effects on HepG2 similar to the original sorafenib, with the IC50 values of 5.02±2.07, 5.97±2.14, 5.40±0.35, and 5.57±0.91 µM, respectively (Sorafenib had IC50 value of 5.97±0.71 µM), but they inhibited approximately 8-10 folds less than doxorubicin (Doxorubicin had IC50 value of 0.59±0.10 µM). For inhibitory activity towards T47-D, the targets 12g (R = p-Cl), 12j (R = p-Br), 12h’ (R = p-Et), and 12p’ (R = p-NHAc) possessed the IC50 values of 5.10±0.80, 6.00±0.06, 10.59±2.03, and 11.28±0.42 µM, respectively, which were up to 3-fold superior and 8-fold inferior to sorafenib (Sorafenib had an IC50 value of 14.80±0.43 µM), and doxorubicin (Doxorubicin had an IC50 value of 0.67±0.07 µM), respectively.

The structure-activity relationships indicated that the substitution on aromatic ring linking a triazole with large alkyl groups, halogen and trifluoromethyl group (CF3) enhanced their cytotoxicity against HepG2 and T47-D. para-Substituted version showed higher inhibitory activities significantly. Furthermore, it was evident that 12e and 12 m’ exhibited the highest selectivity index (SI) towards HepG2, which studied through the cytotoxicity towards normal embryonic lung fibroblast (MRC-5). The SI values of the derivatives were 3.2-4.4 times more than those of sorafenib and doxorubicin. For the binding interaction, the sorafenib derivatives 12m’ and 12e were studied in the B-Raf and VEGFR-2 proteins comparing with sorafenib. Both compounds interacted with the binding sites near to that of sorafenib. The results agreed well with their biological activities.

With these evidences, sorafenib derivatives 12e and 12 m’ have been identified as the potent anti-HepG2 agents with higher safety profile than the original sorafenib and doxorubicin. Their pharmacological properties should be further studied. The candidates could be developed as the agents for the HCC therapy.

โซราเฟนิบ (Sorafenib) เป็นยาชนิดแรกที่ได้รับการรับรองจากองค์การอาหารและยาของสหรัฐอเมริกา (Food and Drug Administration of the United States, US FDA) เพื่อใช้ในการรักษาโรคมะเร็งตับ และต่อมาได้รับการรับรองให้ใช้รักษามะเร็งไต และมะเร็งไทรอยด์ในระยะลุกลาม โดยมีกลไกในการยับยั้งไคเนสหลายชนิด (multikinase inhibitor) โดยเฉพาะ B-Raf และ VEGFR-2 อย่างไรก็ตาม sorafenib ยังมีความสามารถในการดูดซึมเข้าสู่กระแสเลือดต่ำและมีผลข้างเคียงมาก งานวิจัยนี้จึงมุ่งสังเคราะห์อนุพันธ์ sorafenib ชนิดใหม่เพื่อพัฒนาสมบัติทางเภสัชและลดผลข้างเคียงของยา โดยแทนที่ส่วน phenoxy ring ที่เป็นแกนกลาง และ picolinamide ring ของ sorafenib ด้วยวง 1,2,3-triazole ที่เชื่อมต่อกับวงแหวนเบนซีนที่มีหมู่แทนที่ชนิดต่าง ๆ โดยสามารถสังเคราะห์ sorafenib derivative โดยผ่านปฏิกิริยา nucleophilic addition และ 1,3-dipolar cycloaddition ได้อนุพันธ์ทั้งหมด 49 โมเลกุลที่มีร้อยละผลผลิตสูง (ผลงานวิจัยเบื้องต้นของ 13 โมเลกุลถูกรายงานในวิทยานิพนธ์ระดับปริญญาตรี)

จากผลการทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเซลล์มะเร็งตับ HepG2, เซลล์มะเร็งปอด A549, เซลล์มะเร็งถุงน้ำดี HuCCA-1, เซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว MOLT-3 และ HL-60 และเซลล์มะเร็งเต้านม T47-D และ MDA-MB-231 ด้วยวิธี MTT และ XTT assay พบว่า sorafenib derivative มีความสามารถในการยับยั้งเซลล์มะเร็งตับ HepG2 และเซลล์มะเร็งเต้านม T47-D ได้ดีที่สุด แต่อนุพันธ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งชนิดอื่นได้ไม่ดีนัก โดยโมเลกุล 12e (R = o-Cl), 12y (R = p-CF3), 12i’ (R = o-isopropyl) และ 12m’ (R = p-t-Bu) มีฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งตับ HepG2 เทียบเท่ากับ sorafenib ต้นแบบ โดยมี half-maximal inhibitory activities (IC50) เท่ากับ 5.02±2.07, 5.97±2.14, 5.40±0.35 และ 5.57±0.91 µM ตามลำดับ (sorafenib มีค่า IC50 เท่ากับ 5.97±0.71 µM) แต่มีฤทธิ์ยับยั้งน้อยกว่า doxorubicin ประมาณ 8-10 เท่า (doxorubicin มีค่า IC50 เท่ากับ 0.59±0.10 µM) ส่วนการยับยั้งเซลล์มะเร็งเต้านม T47-D นั้น sorafenib derivative 12g (R = p-Cl), 12j (R = p-Br), 12h’ (R = p-Et) และ 12p’ (R = p-NHAc) มีค่า IC50 เท่ากับ 5.10±0.80, 6.00±0.06, 10.59±2.03 และ 11.28±0.42 µM ตามลำดับ มีความสามารถยับยั้งเซลล์มะเร็งเต้านม T47-D ได้ดีกว่า sorafenib สูงที่สุดประมาณ 3 เท่า (sorafenib มีค่า IC50 เท่ากับ 14.80±0.43 µM) แต่น้อยกว่า doxorubicin น้อยที่สุดประมาณ 8 เท่า (doxorubicin มีค่า IC50 เท่ากับ 0.67±0.07 µM) จากการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและฤทธิ์ทางชีวภาพ พบว่าลักษณะโครงสร้างของอนุพันธ์ที่สังเคราะห์ขึ้นสามารถยับยั้งเซลล์มะเร็ง HepG2 และ T47-D ได้ดี โดยเฉพาะหมู่แอลคิล (alkyl) บนวงแหวนเบนซีนที่เชื่อมต่อกับวง 1,2,3-triazole ที่มีขนาดใหญ่ และฮาโลเจน (halogen) และหมู่ไตรฟลูออโรเมททิล (CF3) จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการยับยั้งเซลล์มะเร็งได้ดีขึ้น และการแทนที่ของหมู่แทนที่ที่ตำแหน่ง para จะทำให้โมเลกุลมีฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งได้ดีอย่างมีนัยสำคัญ

จากการศึกษาค่าดัชนีความจำเพาะเจาะจง (Selectivity Index, SI) ได้ศึกษาผ่านเซลล์เยื่อบุผิวปอด MRC-5 พบว่า sorafenib derivative มีความสามารถในการยับยั้งเซลล์มะเร็งตับ HepG2 ได้จำเพาะเจาะจงมากที่สุด โดยที่โมเลกุล 12m’ และ 12e มีค่า SI สูงที่สุด ซึ่งมากกว่ายาทั้งสอง 3.2-4.4 เท่า ในการศึกษา binding mechanism ของ sorafenib derivative 12e และ 12m’ ในโพรงโปรตีน B-Raf และ VEGFR-2 เทียบกับ sorafenib พบว่าสารทั้งสองสามารถเกิด interaction ในตำแหน่งที่ใกล้เคียงกับ sorafenib ซึ่งสอดคล้องกับผลการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ

จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า sorafenib derivative 12m’ และ 12e มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเซลล์มะเร็ง HepG2 ได้ดีและมีความปลอดภัยกว่า sorafenib ต้นแบบและ doxorubicin จึงเป็นโมเลกุลที่จะนำไปศึกษาสมบัติทางเภสัช และสามารถพัฒนาไปเป็นยารักษาโรคมะเร็งตับต่อไป