Genetic stability testing of in vitro-derived plantlets of Pai Sang Mon “Nuan Rajinee” (Dendrocalamus sericeus Munro.) and phytochemical analysis in nine bamboo species

Abstract

Pai Sang Mon “Nuan Rajinee” (Dendrocalamus sericeus Munro.) has a straight and thick clums. The demand of Pai Sang Mon culms has been increased, because its culms are very useful for building construction and furniture making. In addition, many reports showed bamboo leaves contained phytochemicals such as phenolic compounds and flavonoid compounds, that has a potential for commercial uses. From those reasons, this research aimed to investigate the appropriate culture media for shoot induction of Pai Sang Mon from nodal segments and enhanced culture media for shoot multiplication. The genetic stability of in vitro raised Pai Sang Mon plantlets was compared with mother plant using RAPD and HAT-RAPD techniques. Furthermore, leave of nine bamboo species (Pai Sang Mon, Pai Pak King, Pai Dum, Pai Wan Prachin, Pai Lieng, Pai Ruak, Pai Lueang, Pai Namtao and Pai Kim Sung) were investigated to determine the quantities of phytochemicals containing. The results showed that the highest percentage of sterile (83.5%) and the highest percentage of bud-break (100%) were found in the explants which were collected in winter season. The nodal segments which were cultured on a solid medium of Murashige and Skoog's (MS) supplemented with 1.0 mg/l BA and 0.2 mg/l thidiazuron (TDZ) for 3 weeks produced the highest shoots number (5.0 shoots) and the highest shoots length (2.79 cm.). Greenish and healthy shoots multiplication was found when the shoot clumps were cultured on MS medium containing 0.5-1.0 mg/l BA alone or in combination with 0.1 mg/l TDZ, in which the shoot number were 4.2-11.9 shoots and the shoot length were 2.69-2.99 cm. In addition, this research found that the culture media supplemented with 40 mg/l AdSO4, 500 mg/l L-proline, or 200 mg/l PVP-40 increased the efficiency of shoot multiplication. For genetic stability testing, plantlets from nodal segments, which were transferred to fresh medium every 3 weeks for 8 subcultures, were collected. The DNA fingerprint of Pai Sang Mon plantlets was compared with their mother plant using RAPD and HAT-RAPD techniques. Fifteen of primers (7 RAPD primers and 8 HAT-RAPD primers) produced a total of 84 bands (300-3,000 bp in size). Genetic stability of the in vitro-derived Pai Sang Mon plant was found, that implied the true-to-type plant characteristic of clones. For phytochemicals content study, leaves of nine bamboo species were extracted with 60% ethanol. The results showed that bamboo leaf extract (BLE) of Pai Pak King contained the highest of total phenolic contents (5.59±0.14 mg GAE/g DW), total flavonoid contents (25.72±3.20 mM QE/g DW) and antioxidant activity (0.61±0.24 µmol/g DW). Nine bamboo leaf extracts were also studied for the determination of flavone-C-glycosides (standard: isovitexin, vitexin, isoorientin and orientin) using TLC technique. The flavone C-glycoside band showed the highest intensity in Pai Pak King, Pai Sang Mon and Pai Dum, respectively. The three bamboo species were selected to analyze the flavone glycosides by HPLC technique. It was found that BLE of Pai Pak King significantly (P

ไผ่ซางหม่น “นวลราชินี” (Dendrocalamus sericeus Munro.) เป็นไผ่ที่มีลำต้นตรงและเนื้อไม้หนา นิยมนำมาใช้ในงานก่อสร้าง และทำเฟอร์นิเจอร์ ส่งผลให้ความต้องการลำไผ่เพื่อนำไปใช้ประโยชน์เพิ่มสูงขึ้น นอกจากนี้ยังมีรายงานว่าในส่วนใบของไผ่หลายชนิดมีสารพฤกษเคมีที่สามารถนำมาใช้ประโยชน์ทางการค้าได้ เช่น สารประกอบฟีนอลิก และสารประกอบฟลาโวนอยด์ เป็นต้น ในการศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสูตรอาหารที่เหมาะสมต่อการชักนำให้เกิดยอดในไผ่ซางหม่น “นวลราชินี” จากชิ้นส่วนข้อเริ่มต้นด้วยวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ รวมถึงพัฒนาสูตรอาหารที่เหมาะสมต่อการชักนำการเกิดยอดทวีคูณ และตรวจสอบความเสถียรทางพันธุกรรมของต้นไผ่ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเปรียบเทียบกับต้นแม่จากแปลงปลูกด้วยเทคนิค RAPD และ HAT-RAPD นอกจากนี้ยังมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาปริมาณสารพฤกษเคมีในสารสกัดจากใบไผ่ 9 สปีชีส์ และเปรียบเทียบวิธีการจำแนกสารกลุ่ม ฟลาโวนอยด์ด้วยเทคนิค TLC และ HPLC ผลจากการศึกษาพบว่าชิ้นส่วนข้อไผ่ที่เก็บในช่วงฤดูหนาวมี %การปลอดเชื้อ และ %การแตกยอดจากข้อที่ปลอดเชื้อสูงที่สุดเท่ากับ 83.5% และ 100% ตามลำดับ เมื่อนำส่วนข้อมาเพาะเลี้ยงบนอาหารแข็งสูตร Murashige and Skoog’s (MS) ที่เติม BA 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ thidiazuron (TDZ) 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นเวลา 3 สัปดาห์ พบว่าสามารถชักนำการเกิดยอดเฉลี่ย (5.0 ยอด) และความยาวยอด (2.79 เซนติเมตร) ได้สูงที่สุด ส่วนการชักนำให้เกิดยอดทวีคูณในอาหารแข็งสูตร MS ที่ประกอบด้วย BA 0.5-1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร เพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับ TDZ 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร ให้จำนวนยอด 4.2-11.9 ยอด โดยมีความยาวยอด 2.69-2.99 เซนติเมตร ยอดมีสีเขียวและมีลักษณะสมบูรณ์ นอกจากนี้ยังพบว่าการเติม AdSO4 40 มิลลิกรัมต่อลิตร หรือ L-proline 500 มิลลิกรัมต่อลิตร หรือ PVP-40 ความเข้มข้น 200 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการชักนำให้เกิดยอดทวีคูณ เมื่อตรวจสอบลายพิมพ์ดีเอ็นเอของต้นไผ่ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจากชิ้นส่วนข้อเริ่มต้นที่มีการย้ายลงอาหารใหม่ทุกๆ 3 สัปดาห์ รวมทั้งสิ้น 8 รอบการย้ายอาหาร (8 subcultures) เปรียบเทียบกับต้นแม่ที่เก็บจากแปลงปลูกด้วยเทคนิค RAPD และ HAT-RAPD โดยใช้ไพรเมอร์รวม 15 ชนิด (RAPD primer 7 ชนิด และ HAT-RAPD primer 8 ชนิด) ซึ่งให้จำนวนแถบดีเอ็นเอรวม 84 แถบ (ขนาด 300-3000 คู่เบส) พบว่าลายพิมพ์ดีเอ็นเอของต้นที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อไม่แตกต่างจากต้นแม่ที่เก็บจากแปลงปลูก สำหรับผลการศึกษาปริมาณสารพฤกษเคมีในใบไผ่รวม 9 สปีชีส์ ได้แก่ ไผ่ซางหม่น “นวลราชินี” ไผ่ดำ ไผ่ปักกิ่ง ไผ่กิมซุง ไผ่เลี้ยง ไผ่รวก ไผ่หวานปราจีน ไผ่น้ำเต้า และไผ่เหลือง ที่สกัดด้วย 60% เอทานอล พบว่าใบไผ่ปักกิ่งมีปริมาณสารประกอบฟีนอลิกรวม (5.59±0.14 mg GAE/g DW) สารประกอบฟลาโวนอยด์รวม (25.72±3.20 mM QE/g DW) และฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระ (0.61 ± 0.24 µmol/g DW) สูงที่สุด ส่วนผลการศึกษาปริมาณสารฟลาโวนไกลโคไซด์โดยใช้สารมาตรฐาน 4 ชนิด ได้แก่ isovitexin, vitexin, isoorientin และ orientin ด้วยเทคนิค TLC พบว่าสารสกัดจากใบไผ่ปักกิ่ง ไผ่ซางหม่น และไผ่ดำ มีแถบของสารกลุ่มฟลาโวนไกลโคไซด์สูงที่สุด และเมื่อวิเคราะห์ปริมาณสารฟลาโวนไกลโคไซด์ในไผ่ 3 สปีชีส์ ดังกล่าวด้วยเทคนิค HPLC ปรากฏว่าสารสกัดจากใบไผ่ปักกิ่งมีปริมาณ orientin (6.68 µg/ml) และ vitexin (2.81 µg/ml) สูงกว่าไผ่ซางหม่นและไผ่ดำอย่างมีนัยสำคัญ (P